استخراج DNA توسط روش نمکی(Salting Out)

103
استخراج DNA توسط روش نمکی(Salting Out)Reviewed by کنکوران on Feb 27Rating:

 استخراج DNA توسط روش نمکی(Salting Out)

تهیه محلول های مورد استفاده در استخراج DNA

روش تهیه بافر لیز کننده گلبول قرمز(x20)

جهت لیز گلبولهای قرمز از بافر لیز کننده گلبول قرمز استفاده گردید که طرز تهیه آن در زیر آورده شده است.

ابتدا ۳۳۱ گرم  NH4Clو ۴۰ گرم KHCO3در ۶/۱ لیتر آب دوبار تقطیر حل میکنیم سپس بر روی هیتر ۸/۱۴ گرم EDTA اضافه کرده تا با گرما در آب حل گردد. سپس  PHرا باNaOH(5M) به ۴/۷ رسانده و در آخر با آب دو بار تقطیر حجم محلول را به ۲ لیتر می رسانیم و بعد محلول را اتوکلاو میکنیم.

روش تهیه NaOH(5M)

ابتدا ۱۰ گرم   NaOHرا در ۴۰میلی لیتر آب دو بار تقطیر ریخته سپس با  آب دو بار تقطیر حجم محلول را به ۵۰ میلی لیتر میرسانیم.

 

روش تهیه بافر لیز کننده هسته گلبول های سفید

ابتدا ۴۲/۲ گرم  Trisرا در ۶/۱ لیتر آب دو بار تقطیر حل کرده سپس ۸ میلی لیتر  EDTAو ۱۶۰ میلی لیتر  NaOH(5M)اضافه می کنیم. با HCl،  PHرا به ۲/۸ میرسانیم و در آخر حجم محلول را با آب دو بار تقطیر به ۲ لیتر میرسانیم.

 

روش تهیه NaCl-5M

۲/۲۹۲ گرم  NaClرا در ۸۰۰میلی لیتر آب دو بار تقطیر حل و با آب حجم را به ۱ لیتر میرسانیم و در آخر محلول را اتوکلاو می کنیم.

 

روش تهیه اتیلن دی آمید تترا استیک اسید (EDTA)

به منظور تهیه ۱۰ میلی مولار EDTA با PH=8، ۷۲/۳ گرم از پودر مذکور در ۸۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل و PH آن با استفاده از PH سنج و NaOH  مولار در ۸ تنظیم گردید. سپس حجم نهایی محلول به یک لیتر رسانده شد.

 

روش تهیه Tris

جهت تهیه محلول ۱۰ میلی مولار Tris با PH=8،مقدار ۵۷/۱ گرم از پودر Tris در ظرف حاوی ۸۰۰ میلی لیتر آب دو بار تقطیر ریخته و به خوبی هم زده شد. PH  محلول توسط دستگاه PH سنج تنظیم گردید و سپس حجم نهایی محلول به یک لیتر رسانده شد. بعد از استریل نمودن محلول در دمای اتاق نگهداری گردید.

 

روش تهیه  TE

TE برای حل کردن DNA و نگهداری طولانی مدت آن استفاده می شود. ابتدا۵ میلی لیتر   Trisو ۱۰۰ میکرو لیتر   EDTAرا به ۴۰۰ میلی لیتر آب مقطر اضافه کرده سپس با اضافه کردن آب مقطر حجم نهایی را به ۵۰۰ میلی لیتر می رسانیم. محلول حاصل را به ۵ فالکون ۱۰۰ میلی لیتری تقسیم کرده و محلول ها را اتوکلاو می کنیم.

 

روش کار استخراج :

  1. به تعداد نمونه های خون، فالکون ۱۵ میلی لیتری برداشته و ۲ میلی لیتر خون که از بیماران گرفته شده است را درون فالکون ریخته با بافر لیز کننده گلبول قرمز x1 حجم آن را به حدود ۱۳ میلی لیتر رسانده و بعد از بستن در فالکون ها آنها را تکان میدهیم تا خون و بافر مخلوط شوند.
  2. فالکون ها را درون ظرف حاوی یخ قرار داده و به مدت ۱۵تا۳۰ دقیقه روی شیکر می گذاریم.
  3. سپس فالکون ها را از ظرف حاوی یخ در آورده و بمدت ۱۰ دقیقه در ۱۸۰۰ rpm سانتریفیوژ می کنیم.
  4. بعد از سانتریفیوژ در ته فالکون ها رسوب تشکیل می شود، مایع رویی را خالی می کنیم. در این مرحله میتوان دوباره ۱۰میلی لیتر بافر لیز کننده گلبول قرمز اضافه کرده و به مدت ۲۰ دقیقه درون ظرف حاوی یخ بر روی شیکر قرار داده تا تمامی گلبول های قرمز لیز شوند و بعد دوباره سانتریفیوژ می کنیم.(تکرار مراحل ۱ تا ۴)
  5. به رسوب ته فالکون۵/۱ میلی لیتر بافر لیز کننده هسته سلول اضافه کرده و سپس فالکون ها را تکان میدهیم تا رسوب با بافر مخلوط شوند.
  6. به فالکون ۴۵ میکرو لیتر پروتئینازk اضافه کرده و فالکون ها را تکان می دهیم.
  7. به نمونه ها ۱۳۰ میکرو لیتر SDS 10% اضافه کرده و مخلوط می کنیم.
  8. فالکون ها را درون انکوباتور ۳۷درجه سانتیگراد بمدت یک شبانه روز می گذاریم .
  9. فالکون ها را از انکوباتور برداشته ۵/۰ میلی لیتر نمک NaCl(5M) اضافه می کنیم .
  10. فالکون ها را بمدت ۱۵ ثانیه بشدت تکان می دهیم
  11. فالکون ها را بمدت ۱۵ دقیقه در سرعت ۳۰۰۰ rpm سانتریفیوژ می کنیم.
  12. بعد از سانتریفیوژ محلول رویی که باید شفاف باشد را به فالکون ۱۵ میلی لیتری انتقال می دهیم.
  13. در صورت شفاف نبودن محلول، مراحل ۱۰ تا ۱۲ را تکرار می کنیم (میتوانیم برای جواب گیری بهتر و رسوب دادن بهتر پروتئین های موجود در مخلوط فالکون ها را به مدت ۲۰ دقیقه در دمای ۲۰- درجه انکوبه کنیم و بعد از ذوب مجدد آنها سانتریفیوژ را انجام دهیم)
  14. سپس به فالکون ها ۴ میلی لیتر اتانول۱۰۰% اضافه می کنیم و به آهستگی فالکون ها را تکان میدهیم در این مرحله DNA به صورت کلاف سفید رنگ دیده می شود( در هنگام اضافه کردن اتانول باید مراقبت نمود که این کار بصورت آهسته انجام شود چون اگر در هنگام انجام دادن این مرحله با سرعت زیادی اتانول را به مخلوط اضافه کنیم بواسطه ایجاد گسستگی کلاف کامل DNA تشکیل نمیشود و DNAی موجود بصورت قسمتهای ریز و جدا از هم تشکیل میشود)
  15. سپس کلاف DNA را با نوک سمپلر گرفته و به میکروتیوب ۱٫۵ میلی لیتری منتقل می کنیم و با اتانول ۷۰% آن را شسته سپس سانتریفیوژ می کنیم تا DNA به انتهای میکروتیوب بچسبد سپس میکروتیوب را به آرامی روی دستمال کاغذی بر گردانده تا اتانول خارج شود.(میکروتیوب را می توان درون انکوباتور بمدت ۱۵ دقیقه قرار داد تا اتانول کاملا تبخیر شود)
  16. به DNA میکروتیوب ها ۲۰۰میکرولیتر TEاضافه می کنیم.
  17. در میکروتیوب ها را بسته و بمدت ۳۰ دقیقه در ۶۵ درجه سانتیگراد قرار می دهیم یا بمدت چند ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد می گذاریم تا DNA در TE حل شود.
  18. DNA استخراج شده را میتوان به مدت زیاد در دمای ۲۰- درجه سانتیگراد نگهداری کرد.

 

ارسال یک پاسخ

آدرس ایمیل شما منتشر نخواهد شد.

نوزده − 4 =

error: Content is protected !!