روش تکثیر چندگانه همراه با جابجایی یا Multiple displacement amplification-MDA

20
روش تکثیر چندگانه همراه با جابجایی یا Multiple displacement amplification-MDAReviewed by کنکوران on Aug 12Rating:

روش MDA یک روش غیر PCR برای تکثیر DNA می باشد. این روش یک تکنیک برای تکثیر سریع میزان های کم از DNA به مقدار قابل قبول جهت آنالییز های ژنوم می باشد. این واکنش با هیبرید شدن (annealing) پرایمرهای هگزامر تصادفی به DNA الگو شروع می شود.

در این روش از یک DNA پلیمراز با صحت (fidelity) و پیشروندگی (processivity) بالا استفاده می شود که در اغلب موارد از DNA پلیمراز Φ۲۹ (فای ۲۹) استفاده می شود.

این واکنش برخلاف PCR در دمای ثابت انجام می شود.

در مقایسه با PCR در این واکنش تکثیر در اندازه های بزرگتر و خطای کمتر انجام می شود.

این واکنش به میزان زیادی در روند های تکثیری کل ژنوم یا (whole genome amplification (WGA)) انجام می پذیرد همچنین یک روش مناسب برای توالی یابی تک سلولی و تست های ژنتیکی بر اساس توالی یابی می باشد.

بسیاری از موارد پزشکی قانونی که احتیاج به آنالیزهای ژنتیکی بر اساس توالی یابی DNA از نمونه های جزئی مثلا سلول های تکی کشت نشده یا میزان کمی از بافت های انسانی به دست از محل های جنایت دارند از این تکنیک استفاده می کنند.  PCR معمولی بر اساس پرایمرهای مختص توالی و همچنین پلیمرازهای پایدار از نظر دمائی استوار می باشد و می تواند برای تولید میزان زیادی از DNA از یک نمونه اولیه کم مورد استفاده قرار گیرد. با این وجود این روش برای تولید میزان DNA جهت استفاده از تکنیک های مدرن بر اساس آنالیز توالی DNA مناسب نمی باشد. بنابراین یک روش غیر وابسته به توالی برای تکثیر میزان های کم DNA لازم می باشد به خصوص در مطالعات توالی یابی سلول های تک.

DNA پلیمراز باکتریوفاژ فای ۲۹ یک آنزیم با پیشروندگی بالا می باشد که می تواند آمپلیکون های DNA با اندازه های بالاتر از ۷۰کلیو باز تولید کند. این آنزیم یک DNA پلیمراز با صحت بالا با قدرت تصحیح خطا (proofreading) در جهت ۳پریم به ۵پریم می باشد که همین باعث کاهش میزان خطا به اندازه ۱ در ۱ میلیون تا ۱ در ۱۰ میلیون می باشد در صورتی که در  DNA پلیمراز Taq این میزان برابر با ۱ در ۹۰۰۰ می باشد.

روش MDA می تواند در یک دمای یکسان ۳۰ درجه انجام شود بنابراین به دستگاه ترموسایکلر احتیاج ندارد.

پرایمرهای هگزامر

پرایمرهای هگزامر توالی های ۶ بازی با توالی های رندوم می باشند. این پرایمرها معمولا در انتهای ۳ پریم خود یک گروه تیوفسفات تغییریافته دارنده که همین باعث ایجاد مقاومت به خاصیت اگزونوکلئازی ۳پریم به ۵پریم در مقابل DNA پلیمراز فای ۲۹ می شود. واکنش MDAهمراه با اتصال این پرایمرها به DNA الگو شروع می شود که پس از آن با طویلسازی توسط DNA پلیمراز فای ۲۹ همراه دنبال می شود. در حین طویلسازی اتصال پرایمرهای جدید انجام می شود.

واکنش

واکنش تکثیر زمانی شروع می شود که چندین پرایمر هگزامری به DNA الگو متصل می شوند. در این واکنش زمانی که یک فرایند سنتز DNA پیشرفت می کند و به محلی می رسد که پرایمر دیگری متصل شده و یک واکنش دیگر در حال انجام بوده است می رسد، DNA پلیمراز رشته مجاور در حال سنتز را جابجا می کند و به تکثیر خود ادامه می دهد. این بلند شدن رشته های DNA در حال سنتز باعث تولید الگوی های DNA تک رشته ای جدید برای تکثیرهای جدید می شود، که مجدد به این بخش ها نیز پرایمرهای هگزامری متصل می شوند و روند جدید سنتز شروع می شود.

این جابجایی های رشته ها و اتصال پرایمرهای جدید به تک رشته های حاصل شد باعث ایجاد یک شبکه DNA بسیار شاخه دار می شود. شاخه دار شدن توالی های در حین تکثیر باعث افزایش شدید کارائی تولید DNA می شود. برای جدا کردن شبکه DNA از نوکلئاز S1 استفاده می شود که باعث می شود قطعات DNA در بخش هایی که جابجایی انجام شده است بریده شوند. شکاف هایی که در نهایت بر روی قطعات DNA حاصل می شوند توسط DNAپلیمرازI ترمیم می شوند.

 

 

 

ارسال یک پاسخ

آدرس ایمیل شما منتشر نخواهد شد.

سیزده + شش =

error: Content is protected !!