ژنتیک پزشکی : تدریس فصل پنجم ژنتیک پزشکی امری (ایمری)

ژنتیک پزشکی : تدریس فصل پنجم ژنتیک پزشکی امری (ایمری)

✅شناسایی ژن‌های بیماری

💥 نگاه کلی

👈برای شناسایی یک ژن بیماری روش‌های مختلفی وجود دارد که در نهایت در همه این روش‌ها یک ژن کاندید انتخاب می‌شود.

سپس این ژن از نظر وجود جهش در افراد مبتلا مورد بررسی قرار می‌گیرد و به عنوان ژن بیماری تأیید می‌شود. موفقیت شناسایی، بستگی به تأثیر متقابل کارهای آزمایشگاهی، بالینی و بیوانفورماتیکی دارد.

💥💥ژن های کاندید (Candidate genes)💥💥

👈ژنهایی که عملکرد یا محل آنها پیشنهاد می دهد که احتمالا ً مسئول بیماری یا اختلال ژنتیکی ویژه ای باشند ژن کاندید نامیده می-شوند.

👈برای کلون سازی این ژنها باید از الگوی بیان، زمان بندی و توزیع بافت و تیپ های سلولی مطلع بود.

شناسایی یک ژن همولوگ با ژن شناخته شده مسبب یک بیماری وراثتی، احتمال کاندید بودن ژن را برای دیگر ناهنجاری وراثتی با فنوتیپ مشابه بوجود می آورد. مثلاً جهش هایی در ژن کانکسین ۲۶۸ مربوط به آسیب حسی عصبی شنوایی، منجر به شناسایی دیگر کانکسین های مسئول آسیب شنوایی ارثی شده است.

آزمون تأییدکنندگی یک ژن کاندید به عنوان یک ژن بیماری

مراحل:

غربالگری جهش ها در ژنهای کاندید

تأیید آنها با ردیف یابی بازی DNA

بررسی فنوتیپ یکسانی که از جهش های مربوط به از دست دادن عملکرد یا جهش های چندگانه ناشی شده است

حمایت بیشتر از طریق مشاهده بیان ژن کاندید در بافتهای مناسب و در مراحل مرتبط با فرایند نمو و تکوین

ایجاد الگوی جانور ترانسژنیک و یا بازگشت فنوتیپ طبیعی توسط ترانسفکشن ژن طبیعی به درون یک دودمان سلولی

انواع روش‌های شناسایی ژن‌ بیماری:

۱⃣ کلونینگ مکانی یا موقعیتی (Positional cloning)

۲⃣ بررسی ناهنجاری های کروموزومی

۳⃣ مسیرهای مستقل از مکان شامل

💥💥کلونینگ عملکردی💥💥

استفاده از الگوهای جانوری

نقشه کشی ناهنجاری های تکرار سه نوکلئوتیدی

کلونینگ (همسانه سازی) مکانی یا موضعی (Positional cloning)

👈به تعیین نقشه یک اختلال به ناحیه ویژه ای از کروموزوم که سپس به شناسایی ژن مسئول منجر می شود (بدون آگاهی قبلی از فراورده نهایی ژن) کلونینگ مکانی می گویند.

👈کلونینگ مکانی، مسیر اصلی شناسایی ژن‌های مسبب بیماری‌های مندلی بوده و اولین کاربرد موفقیت‌ آمیز آن در انسان‌ها با شناسایی ژن مربوط به بیماری گرانولوماتوز وابسته به X (CGD) صورت گرفته است.

در منطق به‌کار رفته در کلونینگ مکانی سه گام اصلی وجود دارد:

🔮گام اول _ با استفاده از آنالیز پیوستگی بسته به تعداد میوزهای قابل دسترس، ناحیه کاندید شناسایی و تا حد امکان محدود می‌شود.

نوترکیب‌های منفرد مرزهای ناحیه کاندید را مشخص می‌کنند. در این رابطه باید نوترکیب‌های مضاعف، احتمال وجود فنوکپی‌ها و نیز نا‌همگنی لوکوسی مورد توجه و بررسی قرار گیرد.

🔮گام دوم _ لیستی از ژن‌ها در ناحیه کاندید تهیه می‌شود. این کار در ابتدا به روش گام‌زنی کروموزومی (chromosome walking) انجام می‌شد. اکنون یک مرورگر ژنوم مانند Ensembl یا Santa Cruz برای نشان دادن تمامی ژن‌های احتمالی و قطعی از ناحیه کاندید استفاده می‌شود (البته در حال حاضر توالی مرجع مورد استفاده توسط مرورگرها کامل نیست و برای شناسایی قسمت‌های از دست رفته یا قابل تغییر توالی می‌توان به اطلاعات خام بازگشت نمود).
🔮گام سوم _ ژن‌های ناحیه کاندید به منظور بررسی جهش الویت‌بندی می‌شوند. به منظور شناسایی جهش‌ها نمونه‌های یک مجموعه افراد غیرخویشاوند مبتلا تعیین توالی می‌شود.

 (این بخش برای دانشجوهای داوطلب کنکور دکتری کاربردی تر می باشد)

✅ویژگی‌های یک ژن کاندید خوب:

💥بیان مناسب. الگوی بیان ژن باید منطبق با فنوتیپ‌ بیماری باشد و ژن در زمان بیماری یا قبل از آن و نیز در مکانی که بیماری دیده می‌شود، بیان می‌شود ولی لزومی ندارد که بیان محدود به بافت مبتلا باشد. بیان ژن‌های کاندید از طریق RT-PCR، نورترن بلات، SAGE و TISH یا IHC بررسی می‌شود.

💥عملکرد مناسب. به عنوان مثال در کلونینگ مکانیِ یک ژن ناشنوایی، به دلیل اهمیت انتقال یون در گوش درونی برای شنوایی، ژن مربوط به کانال یونی کا‌ندید اصلی خواهد بود.

💥شباهت و ارتباطات عملکردی. شباهت‌های ساختاری و عملکردی در بین گونه‌های خویشاوند دور نیز مشاهده می‌شود (اکثر ژن‌های موش دارای یک نظیر قابل تشخیص در انسان می‌باشد، هرچند می‌توان از اطلاعات مربوط به ژن‌های همولوگ موجودات مدلِ کاملاً مطالعه شده استفاده نمود). هم‌چنین ژن‌های کاندید بر اساس ارتباط عملکردی نزدیک با یک ژن شناخته شده درگیر در یک بیماری مشابه – مانند ارتباطات در یک مسیر رشدی متابولیک یا پیام رسانی- پیشنهاد می‌شوند. البته باید توجه شود که یک مسیر حفظ شده در موجودات مختلف می‌تواند برای یک هدف متفاوت به کار رود. مثلاً اگر ژن انسانی LHX2 به موتانت بی‌بال apterous در دروزوفیلا اضافه شود عملکرد ناقص این موتانت تکمیل و منجر به مگس‌های با بال طبیعی می‌شود، این در حالی است که هیچ جهشی در رابطه با این ژن در انسان دیده نشده است اما در موش‌های واجد حذف عملکردLhx2 ، قبل از تولد با نقایص در رشد چشم‌ها، قسمت جلویی حفره مغز پیشین و اریتروسیت‌ها می‌میرند

💥💥 بررسی ناهنجاری‌های کروموزومی💥💥

گاهی بررسی ناهنجاری‌های کروموزومی منجر به دسترسی به مکان دقیق ژن بیماری می‌شود، برخلاف آنالیز پیوستگی که یک ناحیه کاندید چند مگابازی را پیشنهاد می دهد.

در این مسیر، اگر فردی با ناهنجاری کروموزومیِ به ظاهر متعادل از نظر فنوتیپی غیر نرمال باشد، سه دلیل می‌تواند وجود داشته باشد:

۱⃣ این یک کشف تصادفی بوده است.

۲⃣نوآرایی واقعاً متعادل نیست و اضافه یا حذف شدن‌های کوچک در ماده ژنتیکی وجود دارد ولی قابل مشاهده نبوده است.

در این موارد، به کمک آرایه CGH می‌توان مکان و اندازه ناهنجاری یافت شده را شناسایی نمود. هم‌چنین از تراشه‌های SNP نیز می‌توان استفاده نمود.

🌟مثال‌هایی از کاربرد آرایه CGH در شناسایی نوآرایی‌های به ظاهر متعادل شناسایی ژن‌های بیماری‌هایی چون سندرم BOR (Branchio-oto-renal) با جهش در ژن EYA1 و سندرم CHARGE (نواقص چشمی، ناهنجاری‌های قلبی، فقدان سوراخ حفره خلفی بینی، عقب ماندگی و ناهنجاری‌ اعضای تناسلی و گوش) با جهش در ژن CHD1(پروتئین هلیکاز کرومودومین متصل شونده به DNA ی ۷) بر روی۸q12 است.

۳⃣ یکی از نقاط شکست کروموزوم موجب تخریب یک ژن حیاتی و در نتیجه بروز بیماری می‌شود.

یک شکست کروموزومی می‌تواند موجب تخریب توالی رمزکننده ژن، جدا نمودن آن از ناحیه تنظیمی cis-acting یا قرار دادن ژن تحت اثر مکانی شود.

موقعیت نقطه شکست را می‌توان با استفاده از FISH تعیین نمود. مثالی از این مورد، شناسایی ژن سندرم ساتس بوده است که در آن جابجایی متعادل ۵;۸ ژن NSD1 را در بیمار از کار می‌اندازد.

💥برخی روشهای شناسایی ژن های مستقل از مکان در بیماری های انسان💥

👈کلونینگ عملکردی

شناسایی ژن بیماری انسان را توسط دانش مربوط به فراورده پروتئینی آن توصیف می کند (توجه: به تعیین هویت یک پروتئین یا آنزیم توسط فراورده ژنی آن (عکس کلونینگ مکانی) ژنتیک برگشتی (Surrogate or Reverse genetics) می گویند).

روش کار به این صورت است که بر اساس توالی آمینواسیدی پروتئین، پروب های الیگونوکلئوتیدی سنتز می شوند و به عنوان جستجوگر برای غربالگری کتابخانه cDNA به کار می روند. مشکل این روش هرز بودن کلید رمز ژنتیکی است.

روش های جایگزین شامل موارد زیر است:

🔮تولید یک آنتی بادی برای پروتئین و سپس غربالگری کتابخانه بیان cDNA

🔮رسوب گذاری ایمنی پلی زوم‌هایی که در یک سیستم عاری از سلول، در حال ساخت پروتئین از RNA رمزکننده ژن مربوطه هستند (استراتژی به کار رفته برای شناسایی ژن فنیل آلانین هیدروکسیلار در سال ۱۹۸۲).

🔮شناسایی مستقیم یک پروتئین از طریق آنالیز طیف سنجی جرمی قطعات پپتیدی و جستجوی پایگاه داده‌ها برای شناسایی ژن مربوطه (روش به کار رفته برای شناسایی ژن SUMF1 بر روی ۳p26 که جهش در آن مسبب بیماری نقص در چند سولفاتاز مغلوب اتوزومی (MSD) است).

توجه: ژن SUMF1 توسط گروه دیگری به روش “انتقال کروموزوم بواسطه سلول کوچک” شناسایی گردید. محصول این ژن، سیستئین را به فرمیل گلایسین در جایگاه فعال آنزیم‌های سولفاتاز مختلف (با سوبسترا‌های مختلف) تبدیل می‌کند.

👈تظاهر فاژ (Phage display)

👈بررسی عملکرد یا برهمکنش‌های فراورده ژن

🔮الف) در صورت مشاهده نقص بیو‌شیمیایی یا عملکردیِ مسبب بیماری در سلولهای کشت شده، می‌توان قطعه‌ای از DNA یا پروتئینی که این نقص را تصحیح می‌کند جستجو نمود. به مثا‌ل‌های تکمیل عملکرد زیر توجه نمایید:

شناسایی ژن‌های گروه‌های A ، C و G آنمی فانکونی از طریق غربالگری کتابخانه‌های cDNA و یافتن کلون‌هایی که می‌توانستند نقص در ترمیم DNA را در سلولهای جدا شده از بیماران رفع کنند.

🌟🌟یک مثال کاربردی: شناسایی ژن‌ SUMF1

شناسایی ژن‌های ناشنوایی DFNB3 در انسان و shaker-2 در موش. کلون BAC واجد ناحیه کاندید shaker-2 نوع وحشی، فنوتیپ موتانت را در موش اصلاح کرد و از آنجایی که طبق نقشه‌یابی مقایسه‌ای، لوکوس های DNFB3 و shaker-2 ارتولوگ هستند ژن MYO15 (یک ژن میوزین) انسان بر اساس همولوژی نزدیکش با ژن myo15 در کلون واجد ناحیه shaker-2 نوع وحشی موش شناسایی شد.

🔮ب) اجزای بر همکنش کننده در یک مسیر بیوشیمیایی از طریق مطالعه پروتئین یا RNA شناسایی می‌شوند. به مثال‌های زیر توجه نمایید:

شناسایی ژن‌های BRIPI و PALB2 به عنوان فاکتورهای حساسیت برای سرطان سینه خانوادگی، چرا که محصولات این دو ژن با محصولات ژن‌های حساسیت شناخته شده سرطان سینه یعنی BRCA1 و BRCA2 برهمکنش دارند. این برهمکنش‌ها از طریق آزمایشات Y2H یا طیف سنجی جرمی مطالعه می‌شوند.

پروفایل‌های mRNA بیماران و کنترل‌ها یا سلولها قبل و بعد از بیان پروتئینی که توسط RNAi از کار انداخته شده است با استفاده از ریزآرایه‌ها مقایسه می‌شود.

👈استفاده از الگوهای جانوری

از طریق بازشناسی علایم فنوتیپی در یک جانور الگو مانند موش و مشابهت آن با علایم یک فرد مبتلا به ناهنجاری ارثی، شناسایی سریع ژن مسئول در انسان میسر می گردد مانند:

همولوژی زیاد ژن مسئول سندرم واردنبرگ نوع ۱ (ناهنجاری وراثتی رنگیزه دار شدن و ناشنوایی) در کروموزوم ۲ در انسان با ناحیه جهش یافته رنگیزه ای در کروموزوم ۱ در موش واجد ژن Splotch و Pax3 ⟸ شناسایی PAX3 به عنوان مسئول سندرم واردنبرگ
شناسایی ژن SOX10مسئول سندرم واردنبرگ نوع ۴ از طریق کلونینگ مکانی جهش غالب مگاکلون (Dom) موش.

مطالب مرتبط :

ژنتیک پزشکی : تدریس فصل ششم ژنتیک پزشکی امری (ایمری)

تست های تالیفی فصل چهارم ژنتیک پزشکی ایمری

ژنتیک پزشکی : تدریس فصل چهارم ژنتیک پزشکی امری (ایمری) جلسه اول

تدریس ژنتیک پزشکی

کارشناسی ارشد ژنتیک انسانی در یک نگاه، تعریف، رشته های مجاز، دروس و ضرایب، منابع، زمان آزمون ۹۷-۹۶

منابع مطالعاتی کنکور کارشناسی ارشد ژنتیک انسانی

کلاس های آمادگی کنکور کارشناسی ارشد ژنتیک انسانی

در پایان به دانشجویانی که تمایل دارند از مباحثی که از ژنتیک پزشکی ایمری در کانال ژنتیک پزشکی متعلق به همین سایت تدریس می شود استفاده کنند پیشنهاد می گردد از طریق این لینک به کانال ژنتیک پزشکی بپیوندند.