واکنش زنجیره ای پلیمراز یا PCR – Polymerase Chain Reaction

34
واکنش زنجیره ای پلیمراز یا PCR - Polymerase Chain ReactionReviewed by کنکوران on Aug 16Rating:

واکنش زنجیره ای پلیمراز یا PCR – Polymerase Chain Reaction

PCR یک واکنش مولکولی جهت تکثیر قطعه ای خاص از DNA می باشد. به این دلیل به این روش واکنش زنجیره ای گفته می شود که در طی آن سیکل ها یا حلقه هایی از چرخه دمائی وجود دارد که به اصطلاح حلقه های یک زنجیره به عنوان یک واکنش کلی می باشند.
تکثیر DNA به صورت کلی بر دو اساس انجام می شود.
۱- تکثیر DNA با استفاده از سلول؛ که در این روش از مکانیسم های طبیعی سلول ها (اکثراً سلول های پروکاریوت به واسطه راحت بودن کار با آن ها) برای افزایش و یا تکثیر میزان DNA استفاده می شود. این روش حاوی یک سری مراحل تقریبا دشوار، وقت گیر و هزینه بر می باشد با این وجود در این روش می توان قطعات بزرگ DNA را به میزان زیاد تکثیر کرد.
DNA کلونینگ

۲- تکثیر DNA بدون استفاده از سلول ها یا همان روش های برپایه PCR
PCR یک روش سریع، کم هزینه و تقریباً آسان برای تکثیر DNA می باشد اما خود حاوی محدودیت هایی می باشد از جمله میزان کم تولید DNA و همچنین قدرت تکثیر قطعات کوچک DNA و ….
واکنش PCR در دستگاهی به نام ترموسایکلر انجام می شود. در این دستگاه سیکل های دمائی به تعداد دلخواه قابل اجرا می باشد. این سکیل های دمائی منطبق با همان سیکل های انجام واکنش PCR می باشند. قاعده کلی در مورد سیکل های دمائی PCR بر مبنای ۳۰ یا بیشتر سیکل با ترتیب دمائی به صورت دمای ۹۵ درجه به مدت تقریبی ۱ دقیقه به عنوان مرحله دناتوراسیون (Denaturation)، دمای ۵۵ تا ۶۵ درجه (با توجه به Tm پرایمرها این دما تنظیم می شود) به مدت تقریبی ۱ دقیقه به عنوان مرحله متصل شدن (Annealing) و در نهایت دمای ۷۲ درجه سانتیگراد به مدت تقریبی ۱ دقیقه به به عنوان مرحله گسترش (Extension).

در دمای ۹۵ درجه سانتیگراد رشته های DNA دو رشته ای از هم جدا می شوند یا به اصطلاح DNA یا شکسته شدن پیوندهای هیدروژنی دناتوره می شود. سپس دمای محیط واکنش به ۵۵ تا ۶۵ درجه سانتیگراد کاهش پیدا می کند در این مرحله بواسطه کاهش دما DNA های تک رشته ای شده مجدد تمایل به دو رشته ای شدن دارند. یکی از اجزای مهم واکنش PCR پرایمرها می باشند که این ها عبارتند از یک جفت قطعه کوچک DNA (الیگونوکلئوتید) که با توجه به توالی خود می توانند به بخش هایی از DNA الگو متصل شوند (DNA الگو عبارت است از DNAیی که ما در واکنش PCR قصد تکثیر بخشی از آن را داریم). در زمانی که دمای محیط واکنش به میزان ۵۵ تا ۶۵ درجه سانتیگراد کاهش یافت یا همان مرحله Annealing همه DNA های تک رشته ای شده تمایل به دورشته ای شدن دارند یعنی می خواهند از طریق اتصال به توالی های مکمل خود و برقراری پیوند هیدروژنی دو رشته ای شوند اما به واسطه اینکه اندازه قطعات پرایمر بسیار کوچکتر از سایر بخش های DNA الگو می باشد در این مرحله پرایمرها به محل های مکمل خود متصل می شوند (اتصال رقابتی؛ که در آن پرایمرها به علت کوچکتر بودن پیروز هستند). سپس دمای محیط به ۷۲ درجه سانتیگراد می رسد یا همان مرحله گسترش که در آن DNA پلیمراز شروع به تکثیر می کند.
چرخه های PCR
بواسطه اینکه در روند PCR سیکل های دمائی متعدد وجود دارد که یکی از آن ها دمای ۹۵ درجه سانتیگراد می باشد، در اوایل طراحی این روش به واسطه اینکه پروتئین ها در دمای ۹۵ درجه دناتوره و غیرفعال می شوند و به علت ماهیت پروتئینی آنزیم DNA پلیمراز، در هر مرحله به اجبار DNA پلیمراز جدید به محیط واکنش اضافه می شد. برای رفع این مشکل دانشمندان به فکر استفاده از DNA پلیمراز آرکی باکتری به نام thermus aquaticus افتادند که در چشمه های آب جوش زندگی می کند و به همین دلیل پروتئین های آن نسبت به دمای ۹۵ درجه سانتیگراد مقاومت کافی را دارند پس احتیاج به تعویض DNA پلیمراز در هر سیکل وجود ندارد. به DNA پلیمراز به دست آمده از این موجود taq DNA Polymerase گفته می شود.
بواسطه اینکه این آنزیم در دمای خیلی بالای محیط چشمه های آب داغ عمل می کند بهترین دما برای عملکرد آن برخلاف آنزیم های انسانی و یا باکتریایی به جای ۳۷ درجه سانتیگراد دمای ۷۲ درجه سانتیگراد می باشد ، پس مرحله آخر سیکل های PCR یا همان گسترش در ۷۲ درجه سانتیگراد تنظیم می شود.
اجزای واکنش
برای انجام واکنش PCR یک سری اجزای ضروری است که در زیر آورده شده است.
۱- DNA الگو: به عنوان الگویی برای تکثیر شدن در حین واکنش
۲- DNA پلیمراز: جهت تکثیر DNA از طریق گسترش دادن پرایمرها
۳- پرایمر: پرایمرها به صورت دو الیگونوکلئوتید کوتاه به بخش های مکمل خود بر روی DNA الگو متصل می شوند و محل تکثیر را مشخص می سازند. همه DNA پلیمرازها برای عملکرد خود به یک گروه ۳’OH احتیاج دارند که باید در رشته قرار گرفته باشد تا بتوانند پلیمریزاسیون را شروع کنند، یا به عبارتی این انتهای ۳’OH قرار گرفته در رشته را گسترش می دهند. از همین احتیاج آنزیم های DNA پلیمراز در واکنش PCR استفاده می شود تا آن ها را مجبور به گسترش و تکثیر بخش مورد نظر خودمان بکنیم. بعبارتی را به توجه به توالی ژن مورد نظر به صورتی طراحی می کنیم که ابتدا و انتهای بخش مورد نظر متصل شوند.

PRIMERS

۴- نوکلئوتیدها (dNTPS) به عنوان ماده اصلی جهت تکثیر DNA مورد نیاز می باشند، چون واحدهای ساختاری DNA می باشند.
۵- MgCl2 تمام DNA پلیمرازها برای عملکرد خود به این نمک احتیاج دارند
۶- H2O
۷- BUFFER

واکنش
واکنش PCR به این شکل انجام می شود که اجزای واکنش که بیان شد به محیط واکنش اضافه می کنیم و با استفاده از برنامه دمائی در دستگاه ترموسایکلر سیکل های تکثیری شروع می شوند.
در اولین سیکل دمائی پس از رسیدن دما به ۹۵ درجه سانتیگراد تمام DNA های دو رشته ای از یکدیگر باز شده تک رشته ای می شوند.
پس از رسیدن دما به ۵۵ تا ۶۵ درجه سانتیگراد پرایمرها به محل های خود بر روی DNA الگو متصل می شوند یکی از پرایمرها که به آن پرایمر FORWARD گفته می شود در ابتدای قطعه تکثیر و دیگری که به آن پرایمر REVERSE گفته می شود به انتهای منطقه تکثیری متصل می شود.
باید توجه داشت که هرکدام از پرایمرها به یکی از رشته های DNA دو رشته ای الگو متصل می شوند.
سپس در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد گسترش پرایمرها انجام می شود، این گسترده شدن در اولین دور PCR تا زمانی که به واکنش فرصت داده شود انجام می شود.
PCR
پس از پایان این مرحله اولین بخش های تکثیری ایجاد می شوند که از یک طرف اندازه مشخصی دارند (بواسطه قرارگیری پرایمرها در ابتدای آن ها) اما از یک سمت انتهای نامشخصی دارند.
در دور دوم PCR مجدد دما به ۹۵ درجه سانتیگراد رسیده بخش های دو رشته ای از هم جدا می شوند در مرحله Annealing پرایمرها مجدد به بخش های مکمل متصل شده و در مرحله Extension پرایمرها گسترش پیدا می کنند.
در این مرحله بواسطه اینکه بخش های تکثیر شده از مرحله یک نیز به عنوان الگویی برای سنتز رشته های جدید مورد استفاده قرار می گیرند، و یک سمت این قسمت ها در دور قبل مشخص و تعریف شده بود و بخش دیگر در سنتز انجام شونده در این سیکل مشخص می شود، برای اولین بار محصولات نهایی PCR با اندازه مورد نظر حاصل می شود.

PCR
در سیکل های بعدی نیز همین چرخه تکرار شده و به صورت تصاعدی در مرحله میزان DNA تولیدی دو برابر خواهد شد.

 

 

مطالب مرتبط:

تدریس ژنتیک پزشکی

مقالات و مطالب مرتبط با ژنتیک پزشکی

کارشناسی ارشد ژنتیک انسانی در یک نگاه، تعریف، رشته های مجاز، دروس و ضرایب، منابع، زمان آزمون ۹۷-۹۶

منابع مطالعاتی کنکور کارشناسی ارشد ژنتیک انسانی

کلاس های آمادگی کنکور کارشناسی ارشد ژنتیک انسانی

در پایان به دانشجویانی که تمایل دارند از مباحثی که از ژنتیک پزشکی ایمری در کانال ژنتیک پزشکی متعلق به همین سایت تدریس می شود استفاده کنند پیشنهاد می گردد از طریق این لینک به کانال ژنتیک پزشکی بپیوندند.

ارسال یک پاسخ

آدرس ایمیل شما منتشر نخواهد شد.

یک + دوازده =

error: Content is protected !!