توضیحات فوق العاده PCR قسمت ۱: مقدمات و مراحل اصلی واکنش
یکی از مهمترین و پرکاربردترین تکنیکهای آزمایشگاهی در رشتههای علوم پزشکی و زیستفناوری، واکنش زنجیرهای پلیمراز (Polymerase Chain Reaction یا PCR) هست.
در این سری پستها، به صورت کامل و گامبهگام PCR رو توضیح میدیم. در قسمت اول، با مقدمات و مراحل اصلی واکنش آشنا میشیم.
مراحل اصلی PCR (یک سیکل کامل):
هر سیکل PCR شامل سه مرحله اصلی میشه و معمولاً ۲۵-۴۰ سیکل تکرار میشه تا مقدار DNA هدف به طور تصاعدی افزایش پیدا کنه:
۱. دناتوراسیون (Denaturation)
- دما: حدود 95 درجه سانتیگراد
- مدت زمان: ۲۰-۶۰ ثانیه
- اتفاق: رشتههای دوگانه DNA از هم جدا میشن (دناتوره میشن) و به دو رشته تک تبدیل میشن. این مرحله مثل “باز کردن زیپ DNA” عمل میکنه تا پرایمرها بتونن بچسبن.
۲. انیلینگ (Annealing)
- دما: معمولاً ۵۰-۶۵ درجه سانتیگراد (بسته به طراحی پرایمرها، اغلب ۵ درجه کمتر از Tm پرایمر)
- مدت زمان: ۲۰-۶۰ ثانیه
- اتفاق: پرایمرها (توالیهای کوتاه تکرشتهای) به نواحی مکمل روی DNA تکرشتهای متصل (انیل) میشن. این مرحله خیلی حساسه و دما باید دقیق باشه تا پرایمرها درست بچسبن و غیراختصاصی نشه.
۳. اکستنشن (Extension/Elongation)
- دما: ۷۲ درجه سانتیگراد (دمای بهینه آنزیم Taq Polymerase)
- مدت زمان: ۳۰ ثانیه تا چند دقیقه (بسته به طول قطعه هدف، حدود ۱ دقیقه به ازای هر ۱۰۰۰ جفتباز)
- اتفاق: آنزیم DNA پلیمراز (معمولاً Taq Polymerase مقاوم به حرارت) از روی پرایمرها شروع به سنتز رشته جدید DNA میکنه و رشتههای مکمل رو میسازه.
نکته مهم: بعد از هر سیکل، مقدار DNA هدف تقریباً دو برابر میشه و بعد از ۳۰ سیکل، میلیونها کپی داریم!
در ویدیوی زیر، این مراحل رو به صورت تصویری و با انیمیشن ساده توضیح دادم تا بهتر متوجه بشید:
در قسمت دوم، به جزئیات بیشتر و نکات عملی آزمایشگاهی میپردازیم.
توضیحات فوق العاده PCR ، قسمت 2