• کاریوتایپ، عکسی است که از کروموزم¬ها در مرحله متافاز گرفته می¬شود و برای مطالعه ناهنجاری¬های کروموزمی مورد استفاده قرار می¬گیرد.
• بدین منظور از سلولهای قادر به رشد و تقسیم سریع در محیط کشت مانند گلبول¬های سفید (خصوصاً لنفوسیت T)، فیبروبلاست (از بیوپسی پوست)، سلولهای جنینی (از مایع آمنیون)، پرزهای کوریونی و سلولهای مغز استخوان استفاده می¬شود.
مراحل تهیه کاریوتایپ
۱٫ نمونه¬ای از خون محیطی + هپارین (برای جلوگیری از لخته شدن)
۲٫ جداکردن گلبول¬های سفید (با سانتریفوژ)
۳٫ کشت در محیط مناسب مانند RPMI
۴٫ اضافه کردن معرف سیتوژنیک مانند PHA (فتیوهماگلوتینین) به محیط به منظور تحریک تقسیم سلولهای T
۵٫ انکوباسیون به مدت ۷۲ ساعت
۶٫ اضافه کردن کلشیسین به منظور جلوگیری از تشکیل رشته¬های دوک و توقف سلول در مرحله متافاز
۷٫ قراردادن سلولها در محیط هیپوتونیک مثل KCl به منظور لیز شدن سلولها و چکاندن آنها روی لام
۸٫ فیکس کردن سلولها با حفظ مورفولوژی با استفاده از متانول و اسید استیک
۹٫ رنگ¬آمیزی و مطالعه کروموزوم¬ها
انواع تکنیک¬های Banding
۱٫ (Geimsa) G-banding: با استفاده از تریپسین (واسرشته کننده پروتئین) و گیمسا (۵۰۰-۴۰۰ نوار را در هر مجموعه هاپلوئید ایجاد می¬کند که طول هر نوار Mb 8-6 است)؛ نواحی هتروکروماتینی (AT-rich) تیره و یوکروماتینی (غنی از ژن و CG-rich) روشن مشاهده می¬شوند.
۲٫ (Reverse) R-banding: مانند روش قبل ولی پیش از آن کروموزوم¬ها تحت گرما قرار می¬گیرند؛ نواحی روشن و تیره برعکس G-banding است– برای مطالعه انتهای کروموزوم¬ها، حذف¬ها و نوترکیبی¬های انتهایی به کار می¬رود.
۳٫ Q-banding: با استفاده از رنگ فلوروسنت (Quinacrine، DAPI، هوخِست)، مشابه روش گیمسا نواحی هتروکروماتینی رنگ جذب می¬کنند و تیره مشاهده می¬شوند.
۴٫ رنگ آمیزی (Nucleolar organizing Region) NOR: از رنگ نیترات نقره برای رنگ¬آمیزی ماهواره¬ها یا بازوهای کوتاه کروموزوم¬های آکروسانتریک استفاده می¬شود.
۵٫ C-banding: قبل از رنگ¬آمیزی با گیمسا کروموزوم¬ها ابتدا با اسید و سپس با قلیا تیمار می¬شوند و برای رنگ¬آمیزی سانترومر و نواحی هتروکروماتینی حاوی توالی¬های DNA تکراری به¬کار می¬رود.
۶٫ DA/DAPI banding: از دیستامایسین A (Dystamycin) یا اکتینومایسین D برای نواحی GC-rich و فلوروکروم DAPI برای نواحی AT-rich نظیر قطعات ۱q، ۹q، ۱۶q و قطعه دیستال Yq استفاده می¬شود.
۷٫ T-banding: مانند نوارهای R به ویژه نواحی تلومر را مشخص می¬سازد.
۸٫ رنگ آمیزی با قدرت تفکیک بالا (High Resolution Banding): شامل رنگ¬آمیزی پرومتافازی (کروموزوم¬ها نسبتاً غیر متراکم و بلند هستند) همراه با افزایش دقت تشخیص (۸۰۰ نوار را در هر مجموعه هاپلوئید ایجاد می¬کند) است؛ برای تغییرات جزئی ساختاری و تعیین نقشه ژنی مناسب می¬باشد.
در سیتوژنتیک مولکولی دو تکنیک اصلی به کار میرود:
• دورگسازی فلورسانس درجا (FISH)
• دورگسازی ژنومی مقایسهای (CGH)
در روشهای هیبریدیزاسیون بسته به نوع بررسی دو نوع پروب به کار میرود:
• پروب اولیگونوکلئوتیدی به طول ۵۰-۱۵ نوکلئوتید که به طور سنتتیک به دست میآید.
• پروب نوکلئیک اسیدی که از چند صد نوکلئوتید تا چند کیلوباز است و اغلب از قطعات تخلیص شده DNA ژنومیک یا cDNA به دست میآید.
افزایش طول پروب موجب افزایش اختصاصی شدن هیبریدشدن میشود.
دورگسازی فلورسانس درجا (FISH)
• اساس این روش توانایی قسمتی از DNA تک رشتهای (پروب که با یک فلوروکروم نشاندار شده است) در اتصال با توالی هدف مکمل بر روی کروموزوم متافازی و پرومتافازی، هسته اینترفازی (inter-phase FISH) یا رشته کروماتینی کشیده شده (fiber-FISH) است.
• پس از هیبریدیزاسیون، محل اتصال پروب را میتوان با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس مشاهده نمود.
قدرت تفکیک:
• Metaphase FISH : چند Mb
• Prometophase FISH : 1Mb
• Fiber FISH : چند kb (500)
• Interphase FISH : چند kb
در FISH اینترفازی از نمونههای تازه یا یخزده میتوان استفاده نمود و DNA کروموزومی هدف موجود در نمونه¬های هسته یا سلول تحت تیمار با آنزیم¬های هضم کننده قرار می¬گیرند.
برای پیوستن به کانال تلگرامی تدریس جز به جز منابع ژنتیک پزشکی کارشناسی ارشد و دکتری اینجا کلیک کنید