نکات فصل سوم ژنتیک پزشکی ایمری

نکات فصل سیتوژنتیک ژنتیک پزشکی امری

کاریوتایپ، عکسی است که از کروموزم ها در مرحله متافاز گرفته می شود و برای مطالعه ناهنجاری های کروموزمی مورد استفاده قرار می گیرد.
بدین منظور از سلولهای قادر به رشد و تقسیم سریع در محیط کشت مانند گلبول های سفید (خصوصاً لنفوسیت T)، فیبروبلاست (از بیوپسی پوست)، سلولهای جنینی (از مایع آمنیون)، پرزهای کوریونی و سلولهای مغز استخوان استفاده می شود.
مراحل تهیه کاریوتایپ

1. نمونه ای از خون محیطی + هپارین (برای جلوگیری از لخته شدن)
2. جداکردن گلبول های سفید (با سانتریفوژ)
3. کشت در محیط مناسب مانند RPMI
4. اضافه کردن معرف سیتوژنیک مانند PHA (فتیوهماگلوتینین) به محیط به منظور تحریک تقسیم سلولهای T
5. انکوباسیون به مدت ۷۲ ساعت
6. اضافه کردن کلشیسین به منظور جلوگیری از تشکیل رشته های دوک و توقف سلول در مرحله متافاز
7. قراردادن سلولها در محیط هیپوتونیک مثل KCl به منظور لیز شدن سلولها و چکاندن آنها روی لام
8. فیکس کردن سلولها با حفظ مورفولوژی با استفاده از متانول و اسید استیک
9. رنگ آمیزی و مطالعه کروموزوم ها

 

انواع تکنیک های Banding

1. (Geimsa) G-banding: با استفاده از تریپسین (واسرشته کننده پروتئین) و گیمسا (۵۰۰-۴۰۰ نوار را در هر مجموعه هاپلوئید ایجاد می کند که طول هر نوار Mb 8-6 است)؛ نواحی هتروکروماتینی (AT-rich) تیره و یوکروماتینی (غنی از ژن و CG-rich) روشن مشاهده می شوند.
2. (Reverse) R-banding: مانند روش قبل ولی پیش از آن کروموزوم ها تحت گرما قرار می گیرند؛ نواحی روشن و تیره برعکس G-banding است– برای مطالعه انتهای کروموزوم ها، حذف ها و نوترکیبی های انتهایی به کار می رود.
3. Q-banding: با استفاده از رنگ فلوروسنت (Quinacrine، DAPI، هوخِست)، مشابه روش گیمسا نواحی هتروکروماتینی رنگ جذب می کنند و تیره مشاهده می شوند.
4. رنگ آمیزی (Nucleolar organizing Region) NOR: از رنگ نیترات نقره برای رنگ آمیزی ماهواره ها یا بازوهای کوتاه کروموزوم های آکروسانتریک استفاده می شود.
5. C-banding: قبل از رنگ آمیزی با گیمسا کروموزوم ها ابتدا با اسید و سپس با قلیا تیمار می شوند و برای رنگ آمیزی سانترومر و نواحی هتروکروماتینی حاوی توالی های DNA تکراری به کار می رود.
6. DA/DAPI banding: از دیستامایسین A (Dystamycin) یا اکتینومایسین D برای نواحی GC-rich و فلوروکروم DAPI برای نواحی AT-rich نظیر قطعات ۱q، ۹q، ۱۶q و قطعه دیستال Yq استفاده می شود.
7. T-banding: مانند نوارهای R به ویژه نواحی تلومر را مشخص می سازد.
8. رنگ آمیزی با قدرت تفکیک بالا (High Resolution Banding): شامل رنگ آمیزی پرومتافازی (کروموزوم ها نسبتاً غیر متراکم و بلند هستند) همراه با افزایش دقت تشخیص (۸۰۰ نوار را در هر مجموعه هاپلوئید ایجاد می کند) است؛ برای تغییرات جزئی ساختاری و تعیین نقشه ژنی مناسب می باشد.

در سیتوژنتیک مولکولی دو تکنیک اصلی به کار میرود:

• دورگسازی فلورسانس درجا (FISH)
• دورگسازی ژنومی مقایسهای (CGH)

در روشهای هیبریدیزاسیون بسته به نوع بررسی دو نوع پروب به کار میرود:

• پروب اولیگونوکلئوتیدی به طول ۵۰-۱۵ نوکلئوتید که به طور سنتتیک به دست میآید.
• پروب نوکلئیک اسیدی که از چند صد نوکلئوتید تا چند کیلوباز است و اغلب از قطعات تخلیص شده DNA ژنومیک یا cDNA به دست میآید.

افزایش طول پروب موجب افزایش اختصاصی شدن هیبریدشدن میشود.

 

دورگسازی فلورسانس درجا (FISH)

• اساس این روش توانایی قسمتی از DNA تک رشتهای (پروب که با یک فلوروکروم نشاندار شده است) در اتصال با توالی هدف مکمل بر روی کروموزوم متافازی و پرومتافازی، هسته اینترفازی (inter-phase FISH) یا رشته کروماتینی کشیده شده (fiber-FISH) است.
• پس از هیبریدیزاسیون، محل اتصال پروب را میتوان با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس مشاهده نمود.
قدرت تفکیک:
• Metaphase FISH : چند Mb
• Prometophase FISH : 1Mb
• Fiber FISH : چند kb (500)
• Interphase FISH : چند kb
در FISH اینترفازی از نمونه های تازه یا یخزده میتوان استفاده نمود و DNA کروموزومی هدف موجود در نمونه های هسته یا سلول تحت تیمار با آنزیم های هضم کننده قرار می گیرند.