شناسایی مولکولی جهش های بتا تالاسمی توسط سیستم جهش مقاوم به تکثیر (ARMS) و هیبریدسازی معکوس

شناسایی مولکولی جهش های بتا تالاسمی توسط سیستم جهش مقاوم به تکثیر (ARMS)

Amplification Refractory Mutation System و هیبریدسازی معکوس

چکیده

پیش زمینه: بتا-تالاسمی شایع ترین اختلال در ایران است و در طول ۱۰ سال گذشته، سیستم جهش مقاوم به تکثیر (ARMS) و پلی مورفیسم طول قطعه ی محدود شونده (RFLP) تنها روش های مولکولی مورد استفاده برای تشخیص بیماری بودند. اگرچه بسیاری از جهش های ژنی بتا-گلوبین در جمعیت های چند قومیتی ایران وجود دارند، با این وجود بهره گیری از این روشها در این زمینه پرمشقت، زمانبر و گرانقیمت می باشد. به همین دلیل استفاده از روش هایی مثل هیبریدسازی معکوس و توالی یابی مستقیم در این راستا ضروری خواهد بود.
روش ها: در این مطالعه، هیبریدسازی معکوس همراستا با ARMS برای غربالگی ۱۰ جهش شایع بتا-تالاسمی و هموگولوبین S در ۸۲ بیمار مبتلا به بتا-تالاسمی مینور و ماژور صورت گرفت.
نتایج: از بین ۸۲ بیمار قابل شناسایی با هر دو روش، ۸۰ نفر دارای نتایج مشابهی بودند. هیبریدسازی معکوس نسبت به ARMS، مورد اطمینان، سریع مقرون به صرفه و قابل اجرا است.
نتیجه گیری: با توجه به طیف گسترده ی جهش های بتا-تالاسمی در ایران، یک روش سریع و مورد اطمینان مثل هیبریدسازی معکوس، دارای مزایای بسیار حیاتی در مقایسه با روش های تشخیص سنتی می باشد. در واقع، این روش به عنوان تکنیک انتخابی که می تواند توسط پروژه ی تالاسمی ملی برای شناسایی و تشخیص پیش از تولد بتا-تالاسمی در ایران به کار گرفته شود، توصیه می شود.
مقدمه
بتا-تالاسمی شایع ترین اختلال تک ژنی اتوزومی در سراسر جهان می باشد. این بیماری در بیش از ۶۰ کشور با جمعیت حاملین بالای ۱۵۰ میلیون یافت می شود. در سطح مولکولی، بتا-تالاسمی دارای هتروژنی بسیار بالایی است. زیرا بیش از ۱۹۰ جهش در ژن بتاگلوبین یافت شده که مسئول این بیماری می باشند. منطقه ی مدیترانه ای، برخی از بخش های آفریقای شمالی و غربی، شبه قاره ی هند، جنوب شرق دور و جنوب شرق آسیا و خاورمیانه دارای بالاترین میزان شیوع این بیماری بوده و شامل به اصلاح کمربند تالاسمی هستند.
فراوانی و طیف این جهش ها بین جمعیت های مختلف، متفاوت است. مهاجرت در توزیع و میزان تنوع جهش ها در هر کشور نقش مهمی دارد. ایران با بیش از ۲۵۰۰۰ فرد مبتلا به این بیماری، یکی از مناطقی است که در دنیا دارای شیوع غیر معمول و بسیار بالایی از بیماری بتا-تالاسمی است. فراوانی ژنی تالاسمی دارای تفاوتهای بسیاری در نقاط مختلف ایران است. استان های اطراف خلیج فارس و دریای خزر با فراوانی ژنی بیش از %۱۰ تشکیل دهنده ی مناطق اصلی تالاسمی در ایران می باشند. استان فارس در جنوب ایران دارای فراوانی ژنی %۱۰-۸ است. این در حالی است که شیوع این بیماری حدود %۸-۴ در مناطق مختلف ایران متغیر است.
بهره گیری از روش های تشخیص حساس و مطمئن، نقش مهمی در غربالگری بهتر و متعاقبا توقف بتا-تالاسمی دارد. به دلیل بار اقتصادی و احساس تحمیل شده بر جامعه، شناسایی حاملین بتا-تالاسمی و تشخیص پیش از تولد این بیماری از طریق یک روند دقیق و سریع، هدف اصلی محققان ایرانی در طول دو دهه ی اخیر بوده است. در طول ۱۰-۸ سال اخیر، سیستم جهش مقاوم به تکثیر (ARMS) و پلی مورفیسم طول قطعه ی محدود شونده (RFLP)، تکنیک های اصلی برای تشخیص بوده اند. اگر چه، ایران با یک جمعیت چند قومیتی ۶۵ میلیونی، دارای طیف وسیعی از جهش های بتا-تالاسمی می باشد که استفاده از این روش ها را پرمشقت، آهسته و گران نموده است. بنابراین در سال های اخیر، تکنیک های نوین بیولوژی مولکولی ازجمله هیبریدسازی معکوس و توالی یابی مستقیم برای تشخیص این بیماری مورد استفاده قرار گرفته است. ما کاربردهای هیبریدسازی معکوس برای شناسایی ۱۰ جهش شایع و هموگلوبین S (جدول ۱) را گزارش داده و مزایای آن در مقایسه با ARMS را در شناسایی و تشخیص پیش از تولد جهش های بتا-تالاسمی را نشان می دهیم.

جدول ۱) جهش های بررسی شده توسط ARMS و هیبریدسازی معکوس.

ARMS
ARMS یک روش بر اساس PCR است که از پرایمینگ اختصاصی الل استفاده می کند. در این روش، یک پرایمر الیگونوکلئوتیدی با یک انتهای سه گانه مکمل توالی یک جهش اختصاصی با یک پرایمر رایج مورد استفاده در واکنش PCR جفت می شود. به موازات این حالت، یک پرایمر نرمال متناظر جفت شونده با یک پرایمر رایج در یک واکنش PCR دیگر مورد استفاده قرار می گیرد. حضور یک محصول تکثیر شده در اولین واکنش، نشان دهنده ی وجود جهش است. این در حالی است که فقدان آن، نشان دهنده ی وجود یک توالی نرمال DNA در آن ناحیه می باشد. در دومین واکنش، حضور یک محصول تکثیر شده نشانگر وجود یک توالی DNA ی نرمال در یک ناحیه ی اختصاصی بوده و فقدان آن نیز نشانگر وجود جهش می باشد.(شکل۱)

شکل۱) ژل ARMS-PCR برای تشخیص بتا-تالسمی

مواد و روشها
حدود ۱۰-۸ نمونه خون حاوی EDTA، مایع آمنیوتیک، یا نمونه برداری پرزهای کوریونی (CVS) از بیماران مبتلا با تالاسمی مینور و ماژور که به طور تصادفی انتخاب شده بودند، بدست آمد. DNA با استفاده از روش نمک اشباع، از نمونه ها استخراج شد.
به منظور انجام ARMS، DNAی مورد نظر در ابتدا استخراج گردید. پس از استخراج DNA، واکنش های PCR در دو تیوپ مجزا برای هر نمونه تنظیم شد. یک تیوپ برای تکثیر پرایمر نرمال ARMS و دیگری برای تکثیر پرایمر جهش یافته ی ARMS مورد استفاده قرار گرفت. پرایمر مورد استفاده برای ARMS توسط JM OLD فراهم گردید.
شرایط PCR برای ARMS
حدود ML20 از حجم نهایی واکنش PCR برای این هدف مورد استفاده قرار گرفت. حجم این واکنش شامل ۵/۰ میکروگرم از نمونه ی DNA، ۰۱/۰ میکروگرم از هر کدام از چهار پرایمر( پرایمر کنترل، پرایمر مشترک و پرایمر نرمال / جهش یافته ARMS بر ای واکنش نرمال/ جهش یافته)، ۵/۰ واحد آنزیم DNA پلی مراز Taq و Mm2/0 از هر یک از dNTPها در یک محلول Mm10 از ۱C-tris، mM50 از ۲mgcl و mM1 از اسپرمیدین بود. دماهای هر چرخه (۳۰چرخه) به این صورت است: پیش حرارتی در C94 برای ۲ دقیقه، دناتوراسیون در C94 برای ۱ دقیقه، اتصال متغیر بوده و گسترش در C72 برای ۱ دقیقه می باشد.
شرایط الکتروفورز
پانزده میکرولیتر از محصول PCR حذف شده و با ML3 از بافر بارگذاری مخلوط شده و سپس بر روی یک ژل آگارز %۲ لود می شود. ژل بر روی ولتاژ ۱۰۰ برای ۱ ساعت تنظیم شده و سپس با اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی می شود.
هیبریداسیون معکوس
برای انجام هیبریداسیون معکوس، یک آزمایش تجاری در دسترس (B-گولوبین) روش نوار (آزمایشگاه VIENNA، استرالیا) بر طبق دستورالعمل های تعیین شده توسط تولید کنندگان مورد استفاده قرار گرفت. مناطق مورد نظر از B- گلوبین از DNAی جدا سازی شده در یک واکنش PCR چندگانه ی منفرد با استفاده از سه جفت پرایمر، تکثیر شده و به نوارهای تست از پیش ساخته شده ی حاوی پروب های نوع وحشی و جهش یافته برای چهارده جهش از جمله HBS و HBC هیبرید شدند. پس از چندین بار شست و شو، توالی های محدودی به طور مشخص توسط واکنش رنگ آنزیمی، شناسایی شدند.(شکل ۲).

شکل۲) نوار تست هیبرید سازی معکوس

شکل ۲ نشان دهنده ی مثال هایی از نوار های هیبرید سازی معکوس است. این نوارها شامل پروبهایی برای ۱۴ جهش می باشند. باکس سمت راست نشان دهنده ی نوار مرجع است. در سمت چپ، اولین مورد در هیچ یک از نقاط جهش باندی را نشان نمی دهد. از این رو، این فرد به عنوان یک فرد سالم دسته بندی می شود. دومین مورد، دارای یک تک باند در کدون ۵ از ناحیه ی جهشی است. سومین مورد، دو باند را نشان می دهد: یکی در کدون ۳۹ و دیگری در HBS. چهارمین مورد، دارای یک تک باند در کدون هشت است. در حالی که پنجمین مورد دارای دو باند که هر دو در کدون ۸ واقع اند، می باشد. این مورد تنها فرد در این گروه است که از نوع ماژور می باشد. ششمین مورد نشان دهنده ی یک تک باند در کدون ۹-۸ و هفتمین مورد دارای یک تک باند در توالی مداخله گر (IVS) 1.1 است. هشتمین مورد نشان دهنده ی یک تک باند در ۱٫۶ IVS می باشد. نهمین مورد نیز دارای یک باند در ۲٫۱ IVS می باشد. ۲ نمونه باقی نشان دهنده ی جهش های IVS2.1 توسط هیبریدسازی معکوس هستند. اما منجر به یک نتیجه ی منفی کاذب با روش ARMS نمی شوند. ARMS برای چندمین بار برای این دو نمونه تکرار شده و در یک مورد، پس از دو دور تکرار ARMS، ما یک نتیجه مثبت بدست آوردیم. در مورد دیگر، DNA مجددا برای کسب یک نتیجه ی مثبت، استخراج شد. از ده جهش و هموگلوبین S که در این مطالعه غربال شده بودند، ۱-۲IVS شایع ترین جهش شناسایی شده بود که این نتیجه مطابق با مطالعه ی پیشین گزارش شده توسط NAJMABADI و همکارانش بود. حدود ۷۸ الل جهش یافت شناسایی شدند. این جهش ها شامل ۲۹ عدد ۱-۲IVS، ۱۲ عدد ۱٫۱۱۰، ۷کدون۸، ۷ کدون ۸٫۹، ۶ عدد ۱٫۶IVS، ۵ عدد ۱٫۱IVS، ۳ کدون ۳۹، ۳ عدد ۲٫۷۴۵IVS و ۱ کدون ۵ از الل جهش یافته بودند (جدول ۲).

جدول ۲) تعداد جهش های اختصاصی شناسایی شده توسط ARMS و هیبریدسازی معکوس (HR) در نمونه های DNAی استخراج شده از خون، پرزهای کوریونی (CV) و مایع آمنیوتیک (AF) در بیماران مبتلا به بتا-تالاسمی.

بحث
اخیرا، بیش از ۲۵۰۰۰ نفر مبتلا به بتا-تالاسمی در ایران وجود دارد. تشخیص قبل از تولد راهی برای جلو گیری و کنترل این بیماری می باشد. در این مطالعه ما کاربردهای هیبریدسازی معکوس را برای شناسایی جهش های بتا-تالاسمی و مقایسه ی آن با ARMS که یکی از روش های بسیار رایج برای تشخیص این بیماری در ایران است را معرفی نموده ایم. شایع ترین جهش شناسایی شده، ۲٫۱IVS بود. این یافته در تطابق با یافته های پیشین ما بود.
نتایج ما نشان می دهد که هیبرید سازی معکوس، یک روش مورد اطمینان تر بوده که می تواند نتایج منفی کاذب را نیز کاهش دهد. فقط یک واکنش PCR برای غربالگری بیش از ۲۰ جهش بر روی یک نوار تست منفرد توسط هیبریدسازی معکوس مورد نیاز است. این در حالی است که در روش ARMS، ۸ واکنشPCR برای هر نمونه در راستای شناسایی یک جهش منفرد، مورد نیاز است. این واکنش ها شامل دو واکنش PCR (با استفاده از پرایمرهای نرمال و جهش یافته) برای خود نمونه، کنترل منفی، کنترل مثبت هتروزیگوت و کنترل مثبت هوموزیگوت می باشد. به عبارت دیگر با استفاده از ARMS و با فرض اینکه هر واکنش PCR کار می کند، ما باید از ۸ تا ۸۸ واکنش PCR را برای غربال ۱۱ جهش موجود در مطالعه ی خود انجام دهیم. تکرار یک تست هیبریدسازی معکوس تحت شرایط مشابه، در حال حاضر هیچ مشکلی ایجاد نمی کند. این در حالی است که تکثیر روند ARMS آسان نیست. بر خلاف ARMS که نیازمند یک روش مستند پس از آزمایش است، نوارهای تست هیبرید سازی معکوس، خود مستند بوده و در نتیجه بعدها نیز قابل ذخیره و رجوع آسان بوده و متعاقبا منجر به کاهش خطاها می شود. این فاکتورها همچون افزایش دقت تست ها، زمان صرف شده ی ما را از ۳-۲ روز برای ARMS به ۶ ساعت برای هیبریدسازی معکوس کاهش می دهد. این مورد در ایران که قانون، اجازه ی سقط یک جنین بیمار را تنها در طول ۱۶ هفته ی اول بارداری می دهد، اهمیت بسزایی دارد. بعلاوه، چون بیشتر خانواده ها با یک مرکز تشخیص ژنتیکی فقط پس از حاملگی مشاوره می کنند، زمان محدودی برای شناسایی جهش های احتمالی تأثیر گذارنده بر جنین وجود داشته و از این رو یک روند سریع تر موجب وجود زمان کافی برای تصمیم گیری مناسب والدین می شود. بعلاوه، مقدار مواد اولیه ی مورد نیاز برای انجام یک تست جامع بتا-تالاسمی توسط هیبرید سازی معکوس، تنها شامل یک محصول PCR منفرد با ML5 DNA می باشد. این روش برای تشخیص پیش از تولد که در آن DNAی موجود برای انجام ۱۰ یا بیش از ۱۰ واکنش PCR کافی نیست، دارای اهمیت بالایی می باشد. هیبریدسازی معکوس یک روش ایمن برای محیط است. زیرا از استفاده از کارسینوژن هایی مثل اتیدیوم بروماید اجتناب نموده و ضایعات سمی کمتری را تولید می نماید. از دیدگاه اقتصادی، کاهش زمان انجام کار و بهره گیری از ابزار ساده تر، قیمت تست را در هر نمونه با استفاده از هیبرید سازی معکوس، کاهش می دهد.
در ایران که طیف وسیعی از جهش های بتا-تالاسمی وجود دارد، روشی مثل هیبرید سازی معکوس موثرتر و علمی تر از ARMS است. زیرا همه ی ۲۵ جهش بتا-تالاسمی به طور همزمان بر روی یک نوار در یک زمان کوتاه، قابل غربال است. این مقدار می تواند با طراحی یک نوار دوم (۵۰ جهش در دو نوار) قابل افزایش است.
با این وجود، در سایر کشورها مثل قبرس، که تنها جهش های شناخته شده ی کمی وجود دارد، روشی مثل ARMS کافی به نظر می رسد. جدول ۳، مشخصه های تشخیص دو روش ذکر شده را مورد مقایسه قرار داده است.

جدول۳) مقایسه ی فاکتورهای مختلف تعیین کننده ی بازده ARMS و هیبریدسازی معکوس در تشخیص بتا-تالاسمی

نسخه ی موجود نوار هیبرید سازی معکوس %۶۶-۴۴ (وابسته به منطقه ی واقع در هر کشور) از طیف جهش ها را در ایران پوشش می دهد.یک نسخه توسعه یافته از تست هیبرید سازی معکوس اخیرا ارائه شده است و ۲۲ جهش شامل کدون ۲۲ (۷bpdel)، ۱٫۲۵IVS (bpdel25)، کدون ۳۰ (G«-G) و کدون ۳۶٫۳۷ (T-)، کدون ۴۴ (C-) و ۱٫۱۱۶IVS (G«-C) و جهش هایی که مکررا در جمعیت ایرانیان یافت می شود را پوشش می دهد.
در نتیجه، با افزودن پروب ها برای این جهش های جدید به نوار تست هیبرید سازی معکوس، ما بر این عقیده ایم که این تکنیک بهترین گزینه بوده که می تواند برای شناسایی حاملان و تشخیص پیش از تولد بتا-تالاسمی در ایران مورد استفاده قرار گیرد.

مطلب حاضر ترجمه ای از مقاله لاتین می باشد که فایل لاتین آن در این لینک موجود می باشد.

مطالب مرتبط:

تدریس ژنتیک پزشکی

کارشناسی ارشد ژنتیک انسانی در یک نگاه، تعریف، رشته های مجاز، دروس و ضرایب، منابع، زمان آزمون ۹۷-۹۶

منابع مطالعاتی کنکور کارشناسی ارشد ژنتیک انسانی

کلاس های آمادگی کنکور کارشناسی ارشد ژنتیک انسانی

در پایان به دانشجویانی که تمایل دارند از مباحثی که از ژنتیک پزشکی ایمری در کانال ژنتیک پزشکی متعلق به همین سایت تدریس می شود استفاده کنند پیشنهاد می گردد از طریق این لینک به کانال ژنتیک پزشکی بپیوندند.