ژنتیک پزشکی : تدریس فصل چهارم ژنتیک پزشکی امری (ایمری) جلسه سوم
۲⃣ سیستم مارکر با استفاده از ژن lacz اشرشیا کلی یا سیستم کنترل آبی-سفید برای بتا گلاکتوزیداز
👈آنزیم بتاگالاکتوزیداز می تواند لاکتوز را بشکند و گلوکز و گالاکتوز تولید کند.
👈اما رونویسی از این ژن توسط یک مهار کننده به نام lacI .
👈خود مهار کننده lacI خود توسط لاکتوز یا آنالوگ آن یعنی ایزوپروپیلی بتا دی تیوگالاکتوزید (IPTG) مهار می شود.
👈محصول ژن lacz یا همان بتاگالاکتوزیداز همچنین قادر است که ترکیب بی رنگ X-Gal را به یک ترکیب آبی رنگ تبدیل کند.
💥پس هرگاه در محیط لاکتوز یا IPTG حضور داشته باشد مهار کننده lacI خود مهار شده و در نتیجه lacz بیان می شود.
💥و هرگاه درشرایط بالا در محیط کشت X-Gal حضور داشته باشد به واسطه عملکرد آنزیم lacz کلنی به رنگ آبی تبدیل می شود.
در هنگام استفاده از این سیستم در نوترکیبی ها به این شکل عمل می شود که از میزبان هایی بهره برده می شود که در آن lacZ حضور دارد که انتهای ۵’ آن حذف شده اما بخش ۳’ کاملا سالم است پس بخش N ترمینال پروتئین بتاگالاکتوزیداز تولید نمی شود. به این پروتئین ناقص(آنزیم ناقص) بخش بتا گفته می شود.
در این حالت از ناقل هایی استفاده می شود(برای مثال پلاسمید pUC19) که در آن ها بخش ۵’ حذف شده از ژن میزبان حضور دارد اما بخش ۳’ حضور ندارد و این ناقل می تواند یک آنزیم ناقص را تولید کند که بخش N ترمینال را دارد اما بخش C ترمینال را خیر، به این آنزیم ناقص بخش آلفا گفته می شود و به ژنش بر روی پلاسمید lacZ’ گفته می شود که با ژن کامل اشتباه گرفته نشود. اما این بخش در پایین دست محل اتصال lacI قرار گرفته است، یعنی lacI می تواند باعث عدم بیان این بخش شود مگر اینکه در محیط IPTG یا لاکتوز حضور داشته باشد تا lacI را غیرفعال کند.
پس هرگاه این ناقل بصورت دست نخورده وارد سلول میزبان باکتریایی شود و در محیط IPTG یا لاکتوز حضور داشته باشد به واسطه این که بخش C ترمینال آنزیم توسط ژنوم میزبان حاصل می شود و بخش N ترمینال توسط ناقل، در درون سلول های میزبان یک آنزیم سالم حاصل از دو بخش ایجاد می شود.
🌟به این فرایند تکمیل شدن آلفا می گویند.🌟
حالت اول: هرگاه این باکتری در محیط کشتی باشد که در آن X-Gal حضور داشته باشد، کلنی های آبی تشکیل خواهد شد که نشان از ورود پلاسمید دست نخورده می باشد، ولی وجود پلاسمید دست نخورده درون باکتری به درد عمه باکتری می خورد!!!!!
حالت دوم: به همین دلیل ناقل ها مثل پلاسیمد pUC19 طوری طراحی شده اند که محل ورود DNA جدید دقیقا در داخل بخش کد کننده قسمت Nترمینال آنزیم قرار دارد، یعنی داخل ژن lacZ’، پس هرگاه DNA خارجی وارد پلاسمید شده باشد، حتی در حضور لاکتوز یا IPTG تکمیل شدن آنزیم رخ نمی دهد.
پس در این شرایط که تکمیل شدن رخ نمی دهد خبری از کلنی های آبی رنگ هم نمی باشد.
حالت سوم: همچنین ناقلین در این سیستم دارای ژن مقاومت به آنتی بیوتیک نیز هستند، یعنی هرگاه سیستم ناقل وارد باکتری نشده باشد پس مقاومت آنتی بیوتیکی هم وجود ندارد، و کشت نیز در حضور آنتی بیوتیک انجام می شود، پس هرگاه ناقل وارد نشده باشد اصلا کلنی شکل نخواهد گرفت.
در شکل زیر سه حالت مشخص است.
علاوه بر غربالگری توسط ژن های شاخص روش دیگری هم وجود دارد به نام غربالگری توسط هیبرسیداسیون اسید نوکلئیک
در این روش لازم است که سلول هایی از بین رفته و DNA آن ها استخراج بشود و توسط پروب های نشاندار شده ورود DNA نوترکیب به داخل آن ها اثبات شود:
👈در این روش پس از شکل گرفتن کلنی ها،
👈یک فیلتر نیتروسلولز را بر روی ظرف حاوی کلنی ها قرار می دهیم یا به عبارتی رپلیکا تهیه میکنیم،
👈سپس فیلتر را در درون SDS قرار می دهیم تا باکتری ها لیز شوند و DNA آن ها در دسترس قرار گیرد،
👈بعد از این مرحله فیلتر را به NaOH اغشته می کنیم تا DNA ها دناتوره شوند،
👈در مرحله بعد به فیلتر پروب ها رادیواکتیو مکمل توالی مورد نظر خودمان را (توالی گرفته شده از سلول مادری یا دهنده DNA مورد نظر) را به فیلتر اضافه میکنیم،
👈سپس فیلتر را میشوییم تا پروب های متصل نشده جدا شوند،
👈در این مرحله توسط اشعه X کلنی هایی که به آنها پروب به DNA هدف متصل شده باشد درخشان می باشند، و باتوجه به مکانشان بر روی رپلیکا می توان مکان دقیقش را بر روی ظرف کشت مشخص کرد، که میتوان کلنی نوترکیب را از ظرف مادر به محیط کشت جدید که اغلب محیط مایع می باشد انتقال داد تا میزان زیادی از سلول نوترکیب ایجاد شود و بتوان محصول نهایی را به میزان زیاد به دست آورد.
در شکل زیر تمامی مراحل مشخص می باشد.
مطالب مرتبط :
ژنتیک پزشکی : تدریس فصل چهارم ژنتیک پزشکی امری (ایمری) جلسه چهارم
ژنتیک پزشکی : تدریس فصل چهارم ژنتیک پزشکی امری (ایمری) جلسه دوم
کارشناسی ارشد ژنتیک انسانی در یک نگاه، تعریف، رشته های مجاز، دروس و ضرایب، منابع، زمان آزمون ۹۷-۹۶
منابع مطالعاتی کنکور کارشناسی ارشد ژنتیک انسانی
کلاس های آمادگی کنکور کارشناسی ارشد ژنتیک انسانی
در پایان به دانشجویانی که تمایل دارند از مباحثی که از ژنتیک پزشکی ایمری در کانال ژنتیک پزشکی متعلق به همین سایت تدریس می شود استفاده کنند پیشنهاد می گردد از طریق این لینک به کانال ژنتیک پزشکی بپیوندند.
